Полимеразная цепная реакция (ПЦР-диагностика)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР-диагностика инфекций) основана на определении участков ДНК, специфичных для определенных патогенных микроорганизмов, в образцах биоматериала (соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта, крови или др.). Полимеразная цепная реакция является «золотым стандартом» диагностики большинства бактериальных, вирусных, грибковых инфекций. Тест обладает высокой специфичностью и чувствительностью, поскольку позволяет определять фрагменты ДНК, характерные для конкретного возбудителя, за счет их многократного копирования (амплификации) в лабораторных условиях. Обнаружение патогенов методом ПЦР возможно еще до возникновения симптомов инфекционного заболевания, т. е. на доклинической стадии, а также при латентном течении инфекции и в тех случаях, когда другие лабораторные методики (бактериологические, вирусологические, серологические) еще не дают положительного результата.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), как метод лабораторной диагностики, был запатентован американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году, хотя параллельные исследования в этой области велись некоторыми другими американскими и советскими учеными. Однако именно К. Мюллис считается родоначальником метода ПЦР, за что спустя десятилетие был удостоен Нобелевской премии в области химии. Внедрение ПЦР в клиническую практику совершило настоящую революцию в диагностике инфекционных заболеваний, поскольку сделало возможным быстро (в течение 1-2 дней) выявлять даже самые малые концентрации патогенов, присутствующих в организме. Это позволяет диагностировать не только активные стадии заболеваний, но также их хроническое и скрытое течение. ПЦР исследования находят применение в диагностике вирусных гепатитов, ВИЧ, ЗППП, туберкулеза, респираторных, кишечных, трансмиссивных инфекций и мн. др. В настоящий момент анализы методом ПЦР проводятся повсеместно, во всех крупных лабораториях Москвы.

Сущность исследования

Полимеразная цепная реакция позволяет идентифицировать патогенные микроорганизмы путем выявления их генетического материала (РНК или ДНК) в биологических пробах, взятых от обследуемого человека. Это достигается путем многократного удвоения специфического фрагмента нуклеиновой кислоты патогена в присутствии фермента ДНК-полимеразы в лабораторных условиях. При этом копируется (амплифицируется) только строго определенный участок ДНК, специфичный для конкретного возбудителя, при его наличии в исследуемом материале. Весь лабораторный процесс проходит 3 этапа.

1. Выделение ДНК. Для очистки ДНК от посторонних примесей (белков, крови, слизи) пробу пропускают через сорбент, отмывают, центрифугируют, высушивают. Полученный осадок растворяют, получая очищенную ДНК в элюенте.

2. Амплификация. ПЦР-анализ проводят в амплификаторе – специальном приборе-термостате, который обеспечивает периодическое нагревание и охлаждение пробирок в циклическом режиме с точностью до 0,1°C. Обычно в ходе одного исследования выполняется 20-35 циклов, каждый из которых включает три фазы: денатурации ДНК, отжига и элонгации матричной цепи. На первом этапе пробирку с реакционным раствором, содержащим ДНК-матрицу, два праймера (короткие синтетические олигонуклеотиды, комплементарные концам искомого фрагмента), ДНК-полимеразу, дезоксинуклеотидтрифосфаты, ионы магния и буферный раствор, нагревают до 93-95°С на 30-40 сек. В результате нагрева происходит денатурация – расхождение цепей двухцепочечной ДНК-матрицы вследствие разрушения водородных связей между ними. Затем температуру смеси снижают до 50-65°С, что позволяет праймерам связаться с ДНК-матрицей. Эта фаза ПЦР (фаза отжига) длится не более 2-х минут. Для протекания третьей стадии – элонгации или достраивания матричной цепи – смесь вновь подогревают до 72°С (время третьей фазы зависит от длины амплифицируемого участка – в среднем 20-40 сек.). Таким образом, за два-три десятка циклов в пробирке накапливается множество копий фрагмента ДНК, достаточное для обнаружения, идентификации, качественной или количественной оценки возбудителя.

3. Электрофорез. Полученный субстрат, содержащий продукты амплификации, помещают в лунки с агарозным гелем. Анализатор подключают к источнику тока, проводя электрофорез. Под действием электрического тока фрагменты нуклеиновых кислот разделяются и затем становятся хорошо видимы в трансиллюминаторе в лучах ультрафиолета в виде светящихся полосок оранжевого цвета. В заключении получают изображение (электрофореграмму), которую анализируют на ПК.

Сегодня, наряду с вышеописанной методикой, широкое применение находит ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). От стандартной ПЦР ее отличает добавление в реакционную смесь высокоспецифичных флуоресцентных меток, что позволяет измерять количество амплифицированной ДНК в настоящем времени сразу после завершения каждого цикла. Real-Time ПЦР предоставляет возможность проводить как качественный, так и количественный анализ, благодаря чему делаются выводы о стадии и динамике заболевания, эффективности этиотропной терапии. Также методика используется для генотипирования - определения штаммов вирусов (например, ВПЧ или гепатита В).

Сферы применения

Основные области применения ПЦР-диагностики включают:

• инфекциологию - выявление возбудителей широкого круга воздушно-капельных, трансмиссивных и гемотрансмиссивных инфекционных заболеваний;
• гинекологию, урологию и венерологию – выявление возбудителей урогенитальных инфекций;
• онкологию и гематологию - детекция опухолевых клеток и генов, ассоциированных с онкологическими заболеваниями;
• генетику - диагностика наследственных заболеваний, установление родства и отцовства;
• эпидемиологию – выявление патогенов в пище;
• экологию – мониторинг объектов окружающей среды (почвы, воды);
• судебную медицину – идентификация личности и др.

В клинической медицине ПЦР-анализы чаще всего используются в диагностике различных инфекций (вирусных, бактериальных, паразитарных и др.). Спектр выявляемых вирусов чрезвычайно широк: это могут быть возбудители ВИЧ, гепатитов А, В, С, D, G; цитомегалии, инфекционного мононуклеоза, герпеса 1 и 2 типа, папилломавирусной инфекции (в т. ч. онкогенных типов ВПЧ), клещевого энцефалита и ряда других. В числе бактериальных агентов - хеликобактер пилори, возбудители туберкулеза, листериоза, кампилобактериоза, гарднереллеза, гонореи, сифилиса. Широко востребована ПЦР диагностика в выявлении внутриклеточных паразитов – хламидий, уреаплазм и микоплазм, которых сложно обнаружить другими лабораторными методами, а также инфекций, вызванных грибками и простейшими (кандидоз, трихомониаз).

Специфичность ПЦР в диагностике этих и других инфекций составляет 100%, что значительно превышает таковую у микробиологических, серологических, микроскопических методик. Бесспорным достоинством ПЦР-диагностики является возможность одновременно идентифицировать сразу несколько возбудителей в одной биопробе, поэтому многие лаборатории предлагают комплексные исследования - ПЦР-6, ПЦР-9, ПЦР-12, ПЦР-20 инфекций.

Правила взятия материала

Биологическими образцами, которые могут быть исследованы с помощью ПЦР, могут являться практически любые секреты организма - кровь, слюна, моча, сперма, кал, мокрота, отделяемое половых путей, спинномозговая, плевральная, суставная жидкость, а также эпителиальные соскобы и биоптаты. Однако точность результатов во многом зависит не только от неукоснительного соблюдения методики анализа, но и от правильности сбора и транспортировки исследуемого материала.

Забор любых биологических образцов для ПЦР-диагностики производится в условиях процедурного кабинета. Для этих целей используется исключительно стерильный (желательно, одноразовый) инструментарий и контейнеры. Для взятия крови применяются специальные вакуумные системы и одноразовые пробирки с антикоагулянтом. Соблюдение асептики и антисептики позволяет исключить контаминацию материала извне и, следовательно, получение недостоверных данных.

Существуют определенные требования при подготовке к анализу. Так, перед сдачей мазков и соскобов из урогенитального тракта необходимо за 3 суток до анализа исключить половые контакты, не подмываться антибактериальными средствами, не мочиться за 3 часа. У женщин биоматериал рекомендуется брать накануне менструации или через 1-2 дня после ее окончания, поскольку в эти периоды численность возбудителей инфекции максимально высока. Забор крови для ПЦР-диагностики должен производиться в утренние часы натощак. Если материалом для исследования служит моча, то собирается ее первая утренняя порция. Перед сдачей слюны полость рта требуется трехкратно прополоскать физиологическим раствором.

Взятую пробу необходимо как можно скорее доставить в диагностическую лабораторию (при невозможности незамедлительной транспортировки материал хранится в холодильнике при температуре от +4°С до +8°С). В отношении некоторых видов биоматериала допускается однократное замораживание и оттаивание. Контейнеры (пробирки) с пробами должны быть промаркированы и снабжены направлением на ПЦР-исследование, заполненным по установленной форме. Окончательный результат ПЦР анализа бывает готов уже в течение 1-2 суток (иногда буквально через несколько часов).

Результаты

Качественный результат ПЦР-обследования может быть положительным либо отрицательным. Положительный анализ указывает на выявление искомых инфекционных агентов в исследуемом материале; отрицательный – на их отсутствие. Получение ложноотрицательных результатов практически исключено; их минимальный процент может быть связан с латентной инфекцией или хронической инфекцией вне обострения. Ложноположительные реакции обычно обусловлены человеческим фактором (неправильным сбором, хранением и транспортировкой образцов, нарушением методики проведения ПЦР).

Количественная оценка (определение числа комплектов ДНК или РНК возбудителя в образцах материала, МЕ/мл) позволяет судить о так называемой вирусной/бактериальной нагрузке на организм, т. е. активности течения инфекционного процесса. Количественный анализ помогает подобрать дозу лекарственных препаратов и определиться с длительностью курса лечения. Через 1 месяц после завершения этиотропной терапии проводится контрольное ПЦР-исследование.

Сдать анализы методом ПЦР в Москве можно в специализированных лабораториях и лабораторных отделениях медицинских центров, оборудованных необходимой аппаратурой и тест-системами. Цена на ПЦР зависит от количества определяемых возбудителей, качественного или количественного тестирования, вида анализируемого материала.